Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Преимущества ПЦР-диагностики

Итак, преимущества метода для получения анализов на венерические заболевания, половые инфекции и скрытые инфекции заключаются в следующем:

  1. Точное определение наличия возбудителей венерических заболеваний и половых инфекций.

    Традиционные методы диагностики выявляют белки-маркеры, которые являются продуктами жизнедеятельности инфекций и вирусов, или, например, серологические анализы на венерические заболевания и половые инфекции выявляют антитела к возбудителям заболевания. Такие анализы дают лишь косвенные индикаторы, подозрения на наличие половых инфекций, венерических заболеваний или скрытых инфекций.  То есть может ввести в заблуждение. Анализ ДНК однозначно показывает наличие или отсутствие возбудителя с помощью ПЦР-диагностики.

    В исследуемом материале обнаруживается уникальный, характерный только для конкретного возбудителя участок ДНК. А значит анализы на скрытые инфекции дадут 100%-но достоверный результат. Анализы на венерические заболевания, анализы на половые инфекции эти путем однозначно определяют, какие конкретно бактерии ли вирусы «прописались» в организме. Так называемая нуклеотидная последовательность праймеров исключает ложные результаты.

  2. Высокая чувствительность анализов на венерические заболевания методом ПЦР-диагностики.

    Данный анализ позволяет выявлять даже одинокие клетки вирусов и бактерий, то есть выдает наличие венерических заболеваний и половых инфекций когда другими анализами и исследованиями это сделать не удается. Чувствительность: 10-1000 клеток в пробе, а чувствительность других тестов 103-105 клеток.

  3. Высокая универсальность анализа на венерические заболевания и скрытые инфекции.

    Материалом для ПЦР-диагностики служит ДНК возбудителя. В процессе анализа выявляются фрагменты ДНК или РНК, являющиеся специфичными для конкретного вируса, бактерии, грибка, половой инфекции. Один анализ позволяет диагностировать несколько разных венерических возбудителей, если таковые имеются. Исследовать можно слизь, мочу, мокроту, кровь, соскобы эпителиальных клеток, сыворотку.

  4. Высокая скорость получения результата.

    Для проведения анализа на скрытые инфекции не требуется большого количества времени. Время, которое требуется непосредственно для анализа — не более 5 часов. Метод обработки полученных биоматериалов универсален, биоматериалы подвергаются  специальным реакциям, процесс хорошо автоматизирован.

  5. Возможность выявления любых вирусных, половых инфекций и венерических заболеваний — острых, скрытых, латентных, редких инфекций.

ПЦР-диагностика инфекций особенно эффективна для обнаружения трудно культивируемых, некультивируемых микроорганизмов, скрытых инфекций с антигенной изменчивостью,  а также внутриклеточных паразитов. Приходите в медицинский центр «Норма».

Плюсы и минусы

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Безусловными плюсами этого метода является широкая универсальность. Он может обнаружить очень многих возбудителей, исследовать можно любой биоматериал, от соскобов и до биоптатов тканей, от крови и слюны до мочи и спермы. При необходимой подготовке в одном образце можно сразу поставить реакцию на выявление нескольких возбудителей, провести групповое определение.

Метод ПЦР очень чувствительный, и даже если в исследуемом образце находится всего лишь несколько обрывков ДНК, то можно определить даже раннюю стадию заболевания, включая даже день заражения. Это реакция показана для выявления латентной инфекции, которая никак себя не проявляет, в том числе, если у пациента на фоне иммунодефицита не синтезируются антитела.

Метод ПЦР позволяет проводить быструю диагностику, и уже на следующий день после сдачи анализов получить результат. Наконец, ПЦР — диагностика отличается высокой достоверностью, точностью, и, как показала практика, небольшой стоимостью

Последнее качество очень важно, поскольку при поиске различных инфекций пациенту приходится платить сразу за постановку реакций для поиска нескольких возбудителей. Поэтому количество ПЦР-исследований в каждой крупной лаборатории очень велико

Но не существует совершенных методов исследования. Следует помнить, что далеко не каждая лаборатория может себе позволить проведение анализов ПЦР. Необходим специальный прибор, в котором ставится реакция, и он называется амплификатор. Профессионализм специалистов лаборатории должен быть очень высоким, соблюдение технологии — безукоризненным, а чистота в лаборатории должна быть абсолютной. Также предъявляются высокие требования к чистоте и исходного образца. В том случае, если берется кровь, то необходимо тщательно обработать кожу, иначе в кровь могут попасть частицы микроорганизмов, которые находятся на ее поверхности. Это же относится и к другим образцам, например, смывам из носоглотки, или к вагинальным мазкам.

ПЦР крови на герпес

Исследование крови ПЦР проводится обычно на 1 и 2 тип герпеса одновременно.

  1. тип вызывает в основном поражение губ.
  2. тип чаще поражает гениталии.

Но в редких случаях оба типа герпеса могут обнаруживаться как на губах, так и на гениталиях. Этот вирус не только вызывает крайне неприятные симптомы. Он еще опасен для беременных женщин, потому что провоцирует невынашивание плода или формирование уродств.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Показания к исследованию крови методом ПЦР на герпес:

  • высыпания на половых органах (пузырьки с жидкостью);
  • подготовка к беременности (сдают оба партнера);
  • признаки внутриутробной инфекции;
  • иммунодефицит;
  • профилактическое скрининговое обследование.

При выявлении вируса герпеса диагноз считается подтвержденным, так как ПЦР имеет чувствительность и специфичность, близкую к 100%.

Анализ крови методом ПЦР на туберкулез

ДНК микобактерий может определяться в выпоте, мокроте или смыве бронхов. Анализ крови методом ПЦР на туберкулез очень чувствительный. Поэтому может использоваться для выявления латентной инфекции, не имеющей симптомов. Чаще всего в качестве клинического материала используется мокрота. Пациент может собрать её в любое время.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Смывы бронхов или лаважную жидкость берет врач в условиях стационара. Исследование обычно проводится качественное. Микобактерия или определяется или нет. Так как возбудитель туберкулеза является однозначно патогенным микроорганизмом, его обнаружение методом ПЦР является основанием для установления диагноза.

Анализ крови на хламидии методом ПЦР

Чаще всего на хламидиоз исследуют мазок из уретры. Но не всегда воспалительный процесс при этом заболевании локализован в структурах урогенитального тракта. Хламидии могут поражать дыхательную систему, глаза, ЛОР-органы. Чаще всего в крови определяется фрагмент ДНК Chlamydophila pneumoniae.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Анализ сдают, если:

  • пневмония не поддается лечению медикаментозными средствами;
  • отмечается вялое клиническое течение воспалительного процесса;
  • длительное повышение температуры тела непонятного происхождения.

При обнаружении хламидий назначается этиотропная терапия для эрадикации возбудителя.

Анализ крови на паразитов методом ПЦР

К числу паразитарных заболеваний относятся болезни, вызванные:

  • простейшими одноклеточными микроорганизмами;
  • эктопаразитами (вши, клещи);
  • гельминтами.

Гельминтозы методом ПЦР не диагностируются. Для их определения применяются серологические методы диагностики, направленные на поиск антител в крови. Но анализ крови методом ПЦР может использоваться для обнаружения простейших. Таким способом диагностируется токсоплазмоз.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

ПЦР также используется для определения трихомониаза, но кровь в качестве клинического материала не применяется.

Показания к диагностике крови методом ПЦР на токсоплазмоз:

  • увеличение печени, селезенки, лихорадка неясного происхождения;
  • увеличение и воспаление лимфоузлов;
  • подготовка к беременности или ранние сроки гестации.

Обычно проводится качественное исследование. Результат может быть положительным или отрицательным.

Забор биоматериала

Получив направление, у пациентов возникает вполне закономерный вопрос – как сдаются анализы на инфекции ПЦР?

Прежде всего, берется во внимание, для каких целей проводится исследование:

  1. Выявление половых инфекционных заболеваний. В этом случае берется мазок со слизистой влагалища, цервикального или мочеиспускательного канала, а также сдается моча. Женщинам рекомендовано сдавать анализ перед менструацией или после нее. Анализ ПЦР на хламидии является самым точным способом выявления этих возбудителей, так как не все исследования способны их обнаруживать, а само заболевание хламидиоз нередко протекает бессимптомно. Существует несколько правил, как сдать подобный анализ и получить достоверный результат:
    1. не ходить в туалет «по-маленькому» минимум 3 часа до процедуры;
    2. не пользоваться антибактериальными, дезинфицирующими средствами;
    3. отказаться от полового контакта за 2 суток до сдачи анализа;
    4. перед тем, как сдавать мазок, женщинам не стоит спринцеваться, пользоваться суппозиториями для вагинального введения;
    5. также не следует сдавать анализ во время менструального кровотечения.
  2. Интерпретация результата может исказиться, если сдавать биоматериал во время приема антибиотиков или уросептиков.
  3. Диагностирование инфекционного мононуклеоза. Для исследования сдается слюна, кровь и сывороточная ее часть.
  4. Анализ ПЦР на гепатит С, ВИЧ и другие инфекции. Сдается кровь, сыворотка и плазма, причем используется вакуумная система, поэтому метод минимально травматичен и полученный биоматериал практически изолирован от воздействия окружающей среды. Анализ крови ПЦР сдается на голодный желудок, также нельзя перед сдачей пить. Кроме того, за месяц до процедуры стоит отказаться от приема уросептиков и антибиотиков.
  5. Анализ ПЦР на туберкулез. Выявляется уровень туберкулезных микробактерий (палочек Коха) в мокроте. Этот же материал сдается для выявления микоплазмоза и хламидиоза в респираторной форме. Мокроту собирают в стерильную емкостью.

ПЦР анализ что это такое

Данное исследование является высокоточным способом диагностирования, направленным на выявление инфекции. Базируется на основах генетического материала человека. Такие, как ДНК и РНК. Эта диагностика способна выяснить стадию и присутствие болезни даже на самых начинающихся стадиях и при наличии малого количества патогенных клеток в организме. Что делает ее более исключительной.

ПЦР диагностика заключается в том, чтобы при помощи специального фермента, полимеразы, выявить развивающуюся микробную среду. Во время процесса увеличивают материал ДНК. Если в организме присутствует патогенная флора, ее будет легко увидеть при помощи микроскопа. Для того, чтобы провести анализ ПЦР нужны следующие факторы.

  • определенный компонент ДНК, полимеразы.
  • матрица ДНК.
  • вещества, которые обеспечивают правильную работу ферментов.
  • жидкость, которая способствует выросту, развитию материала.

Применение в медицине

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Расшифровка анализа крови, выполненного методом ПЦР, позволяет быстро и с высокой достоверностью определить наличие в организме пациента возбудителей очень многих заболеваний, которые не растут на искуственных средах. Чаще всего к ним относятся различные вирусы и «капризные» микроорганизмы. Это вирусы папилломы и клещевого энцефалита, цитомегаловирусная инфекция и туберкулез, вирусные гепатиты и мононуклеоз, герпетическая инфекция и ВИЧ-инфекция,  микоплазменная и хламидийная инфекция.

Что показывает анализ? Практически всегда он выполняется качественно, и в заключении дается ответ, есть в образце наследственный материал определенного возбудителя, или его нет, человек заражен, или инфицирования не выявлено. Иногда проводится количественное определение, но оно выполняется реже и стоит дорого дороже.

Большим преимуществом является то, что сдавать кровь на ПЦР вполне можно безо всякой подготовки, в отличие от изучения многих биохимических показателей. Кровь сдается, как обычно, без сложностей. В начале XXI века метод ПЦР — золотой стандарт диагностики различных инфекций. Но, как и у любого способа, у метода ПЦР имеются плюсы и минусы.

Какие варианты проведения имеет метод ПЦР

Наиболее популярными вариантами в лабораториях диагностических являются:

  • с обратной транскрипцией ПЦР;
  • с «горячим» стартом ПЦР – в реакционную среду вводятся блокирующие активность полимеразы антитела, что обеспечивает запуск реакции в строго определенный момент;
  • с анализом результатов по «конечной точке» ПЦР ‑ итог оценивается по наличию флуоресценции в неоткрытом сосуде, что устраняет риск загрязнения реакционной среды (применяются ДНК-зонды с флуорофорной меткой);
  • в режиме «реального времени» ПЦР (ПЦР-РВ, Real-Time PCR) –метод количественный, в котором участвуют красители флуоресцентные, способные встраиваться внутрь спирали ДНК, увеличивая интенсивность свечения, и после каждого цикла копирования по интенсивности флуоресценции определяют количество воспроизведенных молекул;
  • мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР – в одном сосуде амплифицируется две и больше ДНК-последовательности, что позволяет определять несколько патогенов одновременно.

Для различных исследовательских целей применяются следующие варианты метода ПЦР:

  • гнездовая («вложенная») – с двумя праймерными парами, где вторая пара воспроизводит участок ДНК молекулы, полученной в первой реакции, тем самым уменьшая число нежелательных реакций;
  •  «инвертированная» ‑ реализуется, когда известен только маленький фрагмент внутри искомой последовательности (ДНК разрезается ферментами рестриктазами, а затем закольцовывается так, чтобы известные кусочки оказались на конечных участках исследуемого фрагмента);
  • асимметричная – применяется, если надо воспроизвести исключительно одну цепочку молекулы, поэтому один праймер берется в значительном избытке;
  • молекулярных колоний метод – используется акриламидный гель, который полимеризуется с реагентами ПЦР на поверхности и в итоге реакции формируются молекулярные колонии в определенных зонах полимера;
  • длинных фрагментов – проводится амплификация участков из 10 тысяч и более нуклеотидов;
  • ступенчатая – начальные циклы проводятся в высокотемпературных условиях для повышения специфичности сцепления праймеров, а после накопления молекул температура снижается;
  • случайных полиморфных фрагментов (RAPD) – дает возможность дифференцировать микроорганизмы с похожими по структуре ДНК;
  • иммуно-ПЦР – исследуются антигены, а не нуклеиновые кислоты, путем предварительного присоединения антител с ДНК-меткой и последующим воспроизведением;
  • групп-специфическая;
  • с быстрой амплификацией концов кДНК;
  • виртуальная и др.

Выяснив, для чего проводится ПЦР анализ, что это такое (цена заметно различается для разных методов), пациент понимает, чего ему ожидать от исследования.

Что такое полимеразная реакция

Полимераза — это особый фермент, который в соответствующих условиях может многократно умножать, или амплифицировать заданный участок ДНК, копируя его много раз. Этот метод напоминает человека, который вошел в темную комнату с зеркальными стенами, и зажег в ней фонарик. Многократное отражение луча от стен делает комнату светлой, хотя луч из фонарика по-прежнему выходит один. Также и фермент ДНК полимераза, позволяет многократно увеличить количество наследственного материала, делая его концентрацию доступной для определения.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализСама технология этой реакции — достаточно тонкий процесс. В начале необходимо задать точную температуру, которая измеряется десятыми долями градусов. Материал, в котором, возможно, находится наследственный материал возбудителей, нагревают до высокой температуры, чтобы разрушить водородные связи внутри двухцепочечной структуры ДНК.

Затем добавляется в раствор ДНК полимераза, особые праймеры, которые крепятся к свободным концам фрагментов ДНК, откуда и начинает работать полимераза, туда же добавляются нуклеотиды — аденин, гуанин, цитозин и тимин, и проводятся определенный технологические процедуры. В результате на выходе образуется гораздо больше копий с заданными параметрами, чем на входе этой реакции. Если ДНК полимераза успешно справилась с заданием, то многократно умноженный и достроенный фрагмент сверяется с необходимой базой данных, и затем делается заключение о наличие в организме определённого возбудителя.

Для чего необходимо исследование методом ПЦР

В медицинской области находит широкое использование ПЦР диагностика инфекций, в том числе и передаваемых преимущественно половым путем:

  • герпетической, вызванной вирусами герпеса генитального (2 тип); оспы ветряной (3 тип); герпеса простого (тип1); Эпштейна-Барр (4 тип); цитомегаловируса (5 тип); 6-го типа – причины инфекционной розеолы, пневмонии интерстициальной; 7-го типа – причины экзантемы внезапной, предполагаемой причины синдрома хронической усталости; 8-го типа, ассоциируемого с саркомой Капоши;
  • папилломавирусной – с целью выявления типа вируса и его групповой принадлежности (высокой онкогенной активности – 16го, 18го и других типов, связанных с развитием рака шейки матки, низкой – преимущественно 6го и 11го типов, вызывающих появление аногенитальных бородавок);
  • хламидийной (особенно рекомендуется беременным, проводится при первичном обращении к доктору и в 3-ем триместре);
  • мико- и уреаплазменной;
  • гонококковой (диагностика данным методом распространена в РФ);
  • трихомонадной;
  • кандидозной при подозрении на воздействие нетипичных представителей грибов дрожжеподобных рода Candida (Candida nonalbicans, в отличие более привычных Candida albicans, отличаются повышенной стойкостью к обычным противогрибковым препаратам);
  • туберкулезной;
  • ВИЧ;
  • гепатитов и пр.

Помимо этого, метод ПЦР диагностики является основным исследовательским вариантом при подозрении на вагиноз бактериальный.

Позволяя обнаружить такие маркеры данного состояния, как гарднереллы, мобилинкус и пр., определить состав микрофлоры влагалища с целью подбора адекватных терапевтических схем.

ПЦР диагностика используется в обнаружении опухолевых образований и генетических отклонений.

Что такое полимеразная цепная реакция, ПЦР анализ

Модификацией метода является его комбинация с предшествующим разрезанием молекулы ДНК особыми ферментами – эндонуклеазами.

Данное исследование называется ПЦР-рестрикционным анализом продуктов амплификации (PCR RFLP) и распространено в иммунологии.

ПЦР находит применение не только в диагностике инфекционных болезней.

Но также и для выявления наследственных патологий, установления отцовства, в исследовательских целях для введения мутаций, клонирования генов или выделения новых, сращивания ДНК фрагментов.

Все это обуславливает интерес к методу в таких областях, как:

  • судебная медицина;
  • криминалистика;
  • ветеринария;
  • сельское хозяйство;
  • палеонтология;
  • антропология и пр.

Особенности диагностики

Анализ методом ПЦР обладает огромным количеством положительных сторон

В первую очередь, важно отметить чувствительность теста. ПЦР анализатор способен определить молекулы ДНК бактерий даже при их малом количестве, то есть врач получает информацию о ранней стадии заболевания или начале хронической формы недуга

Анализ крови ПЦР способен даже определить наличие инфекционного заболевания, что находится в латентной форме и ничем себя не выдает.

Результаты анализов ПЦР могут быть обширными, так как ПЦР диагностика инфекций может отхватить сразу несколько возбудителей заболеваний, что находятся в одном образце биоматериала. Обследование можно пройти в любое удобное время, что показывает анализ человек может узнать за короткий промежуток времени, так как результаты диагностики биоматериала готовы уже через 5 часов.

Все врачи сходятся во мнении, что анализ крови на ПЦР или другого материала никогда не дает ложные результаты, если правильно соблюдена методика проведения диагностики. ПЦР положительный или ПЦР отрицательный может быть ложным, только при условиях, что лабораторные сотрудники не обладают высоким уровнем профессионализма. Если изъятый биоматериал был загрязнен или его неправильно хранили, то расшифровка анализа ПЦР может иметь искаженные результаты.

Вычленение ДНК первый этап проведения ПЦР-диагностики

Вычленение ДНК является самым первым этапом проведения ПЦР-диагностики. Заключается он в следующем: забранные у больного образцы обрабатываются специальным образом, в результате чего сдвоенная спираль ДНК расщепляется на несколько нитей. Стоит отметить, что с целью обеспечения чистоты реакции в образцы добавляется определенная компонента, позволяющая растворить всю органику. Именно этим способом удаляются аминокислоты, углеводы, липиды, пептиды, полисахариды и белки. Вследствие всех этих манипуляций создается ДНК.

Необходимость подобных мероприятий обуславливается, прежде всего, тем, что в основе ПЦР-диагностики инфекций лежит создание новых ДНК или РНК инфекций. И, конечно, осуществить это, не удалив клеточный материал, нельзя.

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ

ДОБАВИТЬ ОТЗЫВ