Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Иммунная и ферментативная реакции

Как явственно следует из названия, анализ крови ИФА включает в себя несколько составляющих, а именно – иммунную и ферментативную реакции.
Иммунная реакция позволяет связать клеточные элементы и болезнетворные микроорганизмы, а ферментативная дает возможность визуализировать и оценить результат предыдущей реакции.

Рассмотрим каждую реакцию более подробно.

Что такое иммунные реакции?

Иммунными называются специфические реакции, позволяющие связать антиген с антителом и создать иммунный комплекс. Что же это значит? В первую очередь, необходимо понимать, что любая клеточная поверхность содержит молекулы, содержащие данные о клетке, называющиеся антигенами и подразделяющимися на:

  • индивидуальные;
  • видовые.

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Индивидуальные антигены, несмотря на некоторую схожесть, имеют и множество различий. Они имеются у одного конкретного организма и никогда не повторяются в других. Видовые антигены можно обнаружить в организмах тех или иных видов живых существ. Так, например, обезьяны, лошади или собаки имеют свой, ни на что не похожий антиген. Именно поэтому антигены этого типа используются иммунной системой для распознавания своих и чужих клеток, что, собственно говоря, и лежит в основе иммуноферментного анализа крови.

Как распознаются антигены? Здесь все достаточно понятно. Говоря простым языком, клетка, являющаяся иммунной, отлавливает клетку, вызвавшую у нее «подозрение», и сравнивает ее антиген с имеющимся в памяти описанием. Если антиген вызвавшей сомнение клетки соответствует ему, то иммунная клетка «отпускает» ее и отправляется дальше. Если же описание отличается, то ответ организма на угрозу один – уничтожение. Причем распознавание «врага» в данном случае равняется почти 100%.

Иммуноанализ сэндвич-типа Sandwich-type immunoassay

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп — антитело подложки, АТд — детекторное антитело, АГ — антиген, М — метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П — подложка, на которую сорбируется антитело подложки.

В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

I. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

VI. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H2SO4. В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VII. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.

Версия для печати

Подробнее об иммуноглобулинах

Всего человеческий организм вырабатывает 5 известных классов антител, которые обозначаются Ig (что расшифровывается как иммуноглобулины), которые принадлежат классам A, M, G, E, и D. Все они имеют большое значение в интерпретации результатов ИФА – анализа. Конечно, комплексов значительно больше, и далеко не все они еще открыты. Но в диагностике разных болезней наиболее ценны первые три типа антител. Анализ крови на ИФА использует максимум информации: момент появления антител в крови, изменение их концентрации в зависимости от времени, срок исчезновения, а также тип специфических антител.

Так, участниками первичного, острого инфекционного процесса являются иммуноглобулины класса М, которые всегда свидетельствуют об острой фазе, даже в том случае, когда клинически болезнь протекает стерто. Характерный пример – безжелтушная форма острого вирусного гепатита В или С. Иммуноферментный анализ крови на гепатиты покажет, что у человека есть острый гепатит, и такие симптомы, как боли в подреберье, сухость во рту, ломота в суставах и другие неспецифические симптомы становятся легко понятными.

Спустя несколько недель эти антитела обнаруживаются во все более исчезающей концентрации, уступая иммуноглобулинам класса G. Они определяются в крови долгие месяцы, и даже годы, и свидетельствуют или о выздоровлении, и тогда могут оставаться пожизненно, формируя прочный иммунитет. Это свидетельствует о мощной защите от антигенов возбудителей. Так, именно антитела этого класса делают человека невосприимчивым к повторным случаям заболевания сибирской язвой и чумой. Но бывают случаи, когда эти антитела не препятствуют при наличии антигенов их вредному влиянию. В таком случае речь может идти о повышении активности хронического процесса.

Что касается IgE, то он имеет применение в диагностике различных паразитарных инвазий и аллергических состояний, а IgD выполняет вспомогательную функцию: метод иммуноферментного анализа позволяет использовать его в комплексной диагностике бронхиальной астмы и аутоиммунных состояний. Конечно, расшифровка ИФА-анализа значительно более сложная, и специалисты – иммунологи могут рассказать гораздо больше. По каким же показаниям пациент может самостоятельно обратиться в лабораторию, чтобы выполнить исследования?

Как проводят анализ ИФА

В условиях оборудованных лабораторий и медицинских центров определение трепонем методом иммуноферментной реакции может производиться несколькими методами, которые называются прямыми и непрямыми. Однако в основе данных реакций лежит один способ, который позволяет произвести анализ на сифилис методом ИФА. Проводится данный тест определенным образом.

ВАЖНО ЗНАТЬ!

У врача лаборанта имеется специальный планшет – панель с лунками в виде углублений округлой формы в количестве до ста. Используются также специально приготовленные концентрированные антигены к сифилису в наборах для данного анализа, которые помещаются в лунки планшета ИФА. После взятия крови пациента в утренние часы натощак из крови отделяется сыворотка и помещается в лунки с антигенами. В лунках происходит реакция связывания антигена с антителами.

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Метод ИФА на сифилис основан на реакции связывания иммунных соединений первого этапа и конъюгатов со специальной ферментной меткой, которая нужна для считывания качества реакции. На данном этапе помимо ферментной пероксидазы вносится хромогенные красящие вещества, для окрашивания материала в зависимости от исхода реакции.

На основании появившихся окрашенных лунок в планшете производится расшифровка теста. В наборах к различным методам ИФА прилагаются таблицы цветовых схем, по которым определяется количество, уровень иммуноглобулинов, антител из сыворотки пациента в 1 единице объема.

Также для оценки исхода реакции используется специальное оборудование — спектрофотометр для проведения фотометрирования и оценки плотности материала в лунках по сравнению с контрольными пробами. На основании плотности и получают результат, четко установленный для каждого возбудителя сифилиса в пределах норм и патологии.

Общая информация

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Иммуноферментный анализ крови может использоваться для определения уровня гормонов, иммуноглобулинов, комплексов иммунологического типа, а также ряда биологически активных веществ. В качестве материала для такого исследования можно сдать кровь, спинномозговую жидкость, содержимое стекловидного тела и т.д.

Иммуноферментный анализ крови в последнее время применяется все чаще из-за целого ряда преимуществ:

  • чувствительность свыше 90 процентов;
  • стабильное хранение ингредиентов нужных для проведения;
  • быстрая и удобная диагностика;
  • минимальные затраты материалов;
  • автоматизированный процесс;
  • невысокая стоимость.

Кроме этого, анализ крови методом ИФА позволяет на раннем этапе выявить инфекции, в том числе гепатит. Именно поэтому его иногда рекомендуют вместо ПЦР-исследования, а также при беременности. Однако без минусов не обходится. Результаты такого тестирования будут говорить лишь об ответе организма на возбудителя, однако сам он определен не будет. В большинстве случаев рекомендуется сочетание тестов ИФА и ПЦР.

С помощью ИФА тестирования можно узнать результаты по целому набору. В частности, будет определена норма гормонов щитовидной железы, наличие онкомаркеров, ряда инфекций. Норма при этом подбирается для каждого показателя отдельно. Так для взрослых людей ИФА в норме должен продемонстрировать цифры по ТГ в пределах 70 МЕ/мл, по Т4 в промежутке от 64 до 146 нмоль/л, Т3 подсчитывается в количестве 1,8-2,8 нмоль/л.

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

При планировании беременности такое тестирование может сдаваться для определения половых гормонов. В частности, лютеинизирующего. Его значения будут меняться в зависимости от дня цикла. В частности, максимальный показатель, который может наблюдаться, составляет 150, а минимальный 1 мЕд/л.

Когда ИФА используется для определения полового гормона у мужчин, нормальным показателем будет цифра в пределах от 0,5 до 10 мЕд/л. Если исследуется хронический гонадотропин, то результаты будут варьироваться от пола человека. В частности, для взрослых мужчин и женщин при отсутствии беременности показатель должен быть в пределах 5 мЕд/мл. Если же тестирование выполняется во время беременности, то результаты могут быть различные, в зависимости от триместра, вплоть до десятков тысяч единиц.

Что такое хламидиоз

ПЦР, как и ИФА широко применяется в современных лабораториях для диагностики заболеваний, передающихся половым путем. При этом врачи зачастую предлагают выполнить оба теста. Многие пациенты считают, что это лишнее вытягивание денег, однако тесты эти имеют серьезное различие, хотя на первый взгляд могут показаться идентичными. Однако здесь в некоторой степени может быть применена классификация методов психологического исследования

Результаты анализов ПЦР и ИФА часто используются во время беременности, когда нужно исключить хламидийную инфекцию. Зачастую такой положительный результат на инфекцию является ответом на вопрос мужчин и женщин «Почему не получается забеременеть». Кроме риска бесплодия, хламидиоз во время беременности создает риск заражения ребенка.

Главная проблема для диагностики такой инфекции – это бессимптомное протекание. Однако специфические антитела могут быть выявлены уже спустя десять дней после инфицирования. Если ПЦР исследование во время беременности продемонстрирует наличие или отсутствие таких возбудителей, то ИФА расскажет вам в какой стадии сейчас процесс

Такое исследование также важно, чтобы оценить результаты терапии

Расшифровка анализа

Анализ на гепатит или любой другой возбудитель в ИФА исполнении нередко вызывает вопросы. В частности, как проводится расшифровка. На данный момент в результатах указывается один из пяти иммуноглобулинов: IgА, IgM, IgG, IgD, IgE. Выделяются именно они, поскольку роль остальных не была выяснена до конца. Наиболее важными для исследования являются классы А, М и G.

Иммуноглобулин А в первую очередь отвечает за защитные функции слизистых. Результат на их присутствие будет отрицательный, если ведется определение заболевания в его острой форме в самом начале. Появление таких защитных маркеров обычно происходит спустя две недели с начала заболевания. Иногда положительный результат получается и того позже.

Иммуноферментный анализ крови с расшифровкой показателей

Главной функцией данных антител является обнаружение и уничтожение микроорганизмов. Количество их неизменно сокращается, если заболевание стихает. Обычно, спустя восемь недель с начала болезни положительный результат снова будет отсутствовать. Обнаружение иммуноглобулинов класса А в более поздние сроки может говорить о перетекании процесса в хронический.

В качестве главных маркеров, расшифровка которых помогает определить острую фазу патологии, выступают иммуноглобулины, относящиеся к классу М. Обнаружить в крови их можно спустя пять суток после инфицирования. Задерживаются они в крови примерно на шесть недель, после чего исчезновение их происходит быстро.

За формирование остаточного иммунного эффекта отвечают иммуноглобулины класса G. Примерно спустя месяц после инфицирования они начинают обнаруживаться в крови. В дальнейшем определение их растягивается на долгие месяцы. Нередко наблюдать их можно всю жизнь. Такие иммуноглобулины формируются как защитная реакция, которая позволяет исключить повторное инфицирование. Например, такие иммуноглобулины образуются в крови человека, переболевшего в детстве ветрянкой, а соответственно, получившего иммунитет до конца жизни. Конечно, бывают и другие инфекции, повторное возвращение которых возможно. В таком случае анализ обнаружит повторный рост данной группы иммуноглобулинов.

Иммуноглобулины Е используются для выявления паразитов в организме. Иммуноглобулин, относящийся к группе D, расположен в В-лимфоцитах и присутствует в некотором количестве у здоровых людей. Примерно в десятилетнем возрасте им достигаются свои максимальные значения. Количество такого иммуноглобулина растет во время беременности. Кроме этого, наличие его в большем, чем это принято количестве, может быть признаком бронхиальной астмы, иммунодифицитного состояния.

Расшифровка

Антитела, они же иммуноглобулины, делятся на пять классов, но обычно определяются только три из них: М,G и А, которые в организме накапливаются в разные периоды после инфицирования.

Самыми первыми появляются иммуноглобулины М, они же IgM. Возникают они с через 4-5 суток после заражения и в крови находятся полтора месяца, после чего исчезают. Если анализ ИФА показывает их присутствие, мы имеем дело с острым периодом болезни или её обострением.

Недели через три-четыре возникают IgG, то есть иммуноглобулины класса G. Они могут присутствовать у нас несколько месяцев и даже лет подряд. Если анализ ИФА проведен был два раза с промежутком в две недели, а количество IgG в обеих пробах был увеличен, речь может идти об инфекции или повторном заражении ею.

IgA, то есть антитела класса А выявляются уже после обострения инфекции или через месяц после её появления в организме. Большинство из них циркулируют в наших слизистых оболочках и только одна пятая часть – в крови. Пропадают они только после того, как все инфекционные агенты уничтожены, то есть минимум через две недели после заражения, максимум – через восемь.

Если после излечения анализ ИФА показывает их наличие, недуг перешел в хроническую стадию.

Когда расшифровка проводится, нужно обратить внимание еще и на знаки + и – в бланке. Полноценный вердикт может вынести только врач, но о некоторых особенностях организма можно судить исходя из следующих данных:

Полноценный вердикт может вынести только врач, но о некоторых особенностях организма можно судить исходя из следующих данных:

  • Об отсутствии иммунитета к инфекциям свидетельствуют такое сочетание показателей, как JgM , JgG, JgA с минусом везде;
  • О наличии иммунитета после вакцины или инфекции свидетельствуют JgM и JgA со знаком минус и JgG со знаком плюс (JgG (+));
  • Про наличие острой инфекции могут рассказать следующие показатели: JgA (-/+),JgG (-/+) и JgM (+);
  • При обострении хронических инфекций в бланке будут следующие обозначения: JgM, JgG и JgA с плюсами везде;
  • При хронических инфекциях наблюдается следующая картина: JgG (+/-),JgM (-), и JgA (+/-);
  • О выздоровлении свидетельствует пометка JgM (-).

Также нередко проводится такое исследование, как иммуноферментный анализ кровяной сыворотки. Он нужен для исследования гормонов щитовидной железы. Важны здесь показатели таких гормонов, как тироксин, свободный тироксин, трийодтиронин, свободный трийодтиронин и тиреоглобулин.

Кроме того, такое исследование пригодится для диагностики инфекционных и аутоиммунных болезней.

ЧИТАЙТЕ ТАК ЖЕ

ДОБАВИТЬ ОТЗЫВ